Le processus de séparation et de purification des biomacromolécules par chromatographie d'échange d'ions est principalement réalisé en utilisant les propriétés de dissociation de diverses molécules, la charge nette d'ions et la différence électrique de distribution de charge de surface. Elle est devenue l'une des techniques de purification les plus fréquemment utilisées pour la séparation et la purification de produits biochimiques, de protéines, de peptides et d'autres substances.
Lors de la séparation et de la purification, la colonne doit avoir une capacité de charge élevée, un fonctionnement facile et une longue durée de vie. Le milieu de séparation est le facteur le plus important. Par conséquent, le choix du milieu de séparation est particulièrement important.
1. Sélection des variétés:
Un convenablemilieu de chromatographie d'échange d'ionsdoit être choisi en fonction du type de charge, de la taille de la molécule, des propriétés physico-chimiques et du microenvironnement du produit cible à séparer et à purifier. Pour les petites molécules inorganiques, le choix du milieu de séparation est relativement facile, mais davantage de facteurs doivent être pris en compte pour les biomacromolécules.
Les biomacromolécules telles que les protéines sont composées d'une variété d'acides aminés, qui présentent différentes propriétés électriques dans différentes conditions de pH, et les biomacromolécules ont des exigences spécifiques pour l'environnement de pH le plus approprié. Par conséquent, il est nécessaire de comprendre d'abord la protéine cible, etc. Le point électrique et le micro-environnement approprié, selon ces conditions, sélectionnent l'espèce d'échangeur d'ions appropriée.
Le choix d'un échangeur de cations ou d'un échangeur d'anions dépend principalement de la charge du matériau séparé à son pH stable. S'il est chargé positivement, l'échangeur de cations est sélectionné; s'il est chargé négativement, l'échangeur d'anions est sélectionné. Par exemple, le point isoélectrique de la protéine à séparer est de 4 et la plage de pH stable est de 6-9. Puisque la protéine est chargée négativement à ce moment, un échangeur d'anions doit être sélectionné pour la séparation.
2. Sélection du squelette:
L'échangeur d'ions à matrice (matrice) approprié doit être choisi en fonction du rendement du produit cible, de la pureté requise et de la valeur économique.
La résine échangeuse d'ions polystyrène à usage général présente les caractéristiques d'une structure stable, d'un prix bas, d'une capacité d'échange totale élevée et convient au processus d'extraction et de séparation de produits biochimiques généraux tels que les antibiotiques, les acides organiques, les ressources animales ou les ressources végétales. Pour certains produits de génie génétique à haute valeur ajoutée nécessitant une haute résolution et une grande pureté du produit, des milieux de séparation biochimiques à base de cellulose, de dextrane et d'agarose sont toujours nécessaires.
Les échangeurs d'ions cellulosiques sont relativement peu coûteux, mais ont une résolution et une stabilité faibles et conviennent pour la séparation initiale et la préparation en vrac. La résolution et le prix de l'échangeur d'ions dextrane sont modérés, mais l'influence externe est importante et le volume peut changer considérablement avec le changement de force ionique et de pH, affectant la résolution. Les échangeurs d'ions agarose ont une bonne stabilité mécanique et une haute résolution, mais ils sont plus chers.
Le milieu de séparation idéal doit non seulement être facilement adsorbé, mais également facile à éluer. Si le produit cible n'est pas sensible aux changements de force ionique et de pH, un milieu fort avec une forte charge ou une forte alcalinité avec une densité de charge élevée peut être envisagé. Si ces facteurs sont sensibles, des milieux faibles ou faiblement alcalins doivent être utilisés. Si la substance macromoléculaire est adsorbée, la combinaison est relativement forte et elle est souvent difficile à éluer. Si des conditions difficiles sont utilisées pour provoquer la dénaturation des macromolécules, un milieu avec une faible densité de groupes fonctionnels doit être sélectionné.
Milieu fortement acide ou fortement alcalin avec une large gamme de pH. Il est souvent utilisé pour séparer de petites molécules ou se séparer à un pH extrême. Cependant, en raison de ses fortes propriétés électriques, il dénature parfois facilement ou perd en direct certaines biomolécules sensibles. Les milieux faibles faiblement acides ou faiblement alcalins ont une large gamme de sélectivité et ne sont pas faciles à inactiver les protéines. Par conséquent, ils conviennent généralement pour séparer des macromolécules telles que des protéines, mais leur gamme de pH est étroite.
3. Sélection de la taille des particules:
La taille du milieu de séparation a un effet significatif sur la résolution et le débit de la colonne de chromatographie échangeuse d'ions. Généralement, le milieu de séparation a une petite taille de particules et une résolution élevée, mais l'ion d'équilibre a un long temps d'équilibre et un débit lent; lorsque la taille des particules est grande, la colonne a un débit relativement rapide et une faible perte de charge, mais la résolution est faible et la charge est faible. Par conséquent, le milieu de séparation de grosses particules convient pour une séparation préparative à grande échelle qui n'est pas requise pour la résolution, et le milieu de séparation de petites particules convient pour une séparation fine nécessitant une haute résolution ou une étape de raffinage du produit.
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